甲胎蛋白（AFP）的糖基化及配體結(jié)合

甲胎蛋白（AFP）是一種69 kDa的胎兒血清糖蛋白，主要在胎兒肝臟和卵黃囊中合成，半衰期為4-5天。除了妊娠期AFP水平較高外，肝癌患者血漿中AFP濃度也較高，被公認為最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物之一。越來越多的證據(jù)表明AFP在肝細胞癌（HCC）的發(fā)生發(fā)展中起著重要的生物學作用。AFP促進HCC細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細胞凋亡，增強干性基因的表達。這些惡性功能是通過cAMP-PKA、RA-RAR、Caspase3、PTEN、PI3K/AKT/mTOR等信號通路激活或抑制下游靶基因表達而實現(xiàn)的。AFP還具有免疫抑制功能，例如，AFP抑制DC線粒體代謝，誘導DC凋亡，增強NK細胞的細胞毒性，改變CD4⁺/CD8⁺ T細胞的比例，從而抑制T細胞介導的細胞毒性。此外，AFP影響巨噬細胞分化和吞噬活性。AFP通過參與免疫調(diào)節(jié)，促進HCC細胞的免疫逃逸。

1. AFP的糖基化特征

AFP的糖蛋白變異最初是用神經(jīng)氨酸酶和刀豆蛋白A鑒定和分離的。隨后通過各種凝集素確定了甲胎蛋白中的糖鏈類型，并發(fā)現(xiàn)妊娠和腫瘤發(fā)生期間甲胎蛋白的聚糖組成不同。1990年，研究人員利用氫核磁共振（1H-NMR）技術(shù)成功鑒定了AFP糖肽結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜和相關(guān)技術(shù)的進步促進了AFP糖肽類型的有效鑒定，促進了AFP作為腫瘤標志物的發(fā)展。

1.1 AFP的糖基化修飾位點

N鏈糖基化是一種共翻譯或翻譯后修飾，其中糖鏈連接到特定的天冬酰胺殘基上，具有一致的氨基酸序列N-X-S/T，其中X代表除脯氨酸以外的氨基酸。研究人員在AFP的Asn251中檢測到一個額外的電子密度圖。AFP中N251周圍的氨基酸序列為TKVNFTEIQ，符合N-鏈糖基化標準，因此推測這種密度就是糖鏈結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE分析觀察到AFP絲氨酸（N251S）突變成天冬酰胺后具有更高的電泳遷移率（圖1b），表明該突變導致糖基化喪失，降低了AFP的分子量，這進一步證實了該密度為糖基化修飾。

1.2 天然與腫瘤源性AFP的糖基化差異

對正常HEK 293F細胞和肝癌細胞Bel7042提取的AFP（293-AFP和7402-AFP）進行糖基化質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，AFP在殘基N251上的N鏈糖基化組成不同。兩種細胞系A(chǔ)FP的多糖組成均含有濃縮多糖，濃縮多糖的比例均超過總多糖的75%。這表明來自兩種細胞系的AFP都傾向于AFP-L3，AFP-L3的特點是在其聚糖鏈的N-乙酰氨基葡萄糖還原端有一個α-1,6-聚焦殘基。兩種細胞系來源的AFP主要聚糖組成不同，293-AFP的主要聚糖組成為HexNAc(5)Hex(4)Fuc(1)，占26.82%，而7402-AFP的主要聚糖組成為HexNAc(4)Hex(5)Fuc(1)，占44.44%。

腫瘤源性AFP（tAFP）和臍帶天然AFP（nAFP）糖基化的主要區(qū)別在于核心多糖是否與巖藻糖殘基相連，nAFP通常缺乏巖藻糖殘基，但也有特例。AFP聚糖組成的差異可能最終導致功能差異，例如腫瘤源性AFP（tAFP）可直接誘導NK細胞和DC細胞凋亡。

圖1. AFP的N-糖基化

注：a.一個連接到AFP Asn251的附加電子密度圖。密度圖根據(jù)AFP子域進行顏色編碼，額外電子密度圖用紅色標記。AFP序列符合N鏈糖基化序列模式。b. AFP和突變AFP（N251S）的SDS-PAGE分析。c. AFP的寡糖結(jié)構(gòu)。這種低聚糖被稱為β-D-甘露吡喃糖-(1-4)-2-乙酰氨基葡萄糖-2-脫氧-β-D-葡萄糖吡喃糖-(1-4)-2-乙酰氨基葡萄糖- 2-脫氧-β-D葡萄糖吡喃糖。

2. AFP的金屬離子結(jié)合

2.1 金屬離子結(jié)合位點

金屬離子通過參與氧化還原反應(yīng)、電子轉(zhuǎn)移、酶催化和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等各種過程，在生物系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究人員在AFP IA結(jié)構(gòu)域中，發(fā)現(xiàn)了一個金屬離子結(jié)合位點，涉及四個氨基酸His22、His264、His268和Asp280（圖4a）。有趣的是，金屬離子并非在蛋白質(zhì)提取過程中引入的，電子密度圖表明在培養(yǎng)基中就存在AFP與金屬離子的結(jié)合。

將AFP的4個氨基酸突變?yōu)楸彼幔玫酵蛔凅wAFP-4mut（H22A、H264A、H268A和D280A）。在此之后，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）評估金屬離子與野生型AFP和突變型AFP-4mut蛋白的結(jié)合。結(jié)果表明，突變體AFP-4mut中金屬與蛋白質(zhì)的摩爾比降低，特別是鎂、鋁、鎳和鋅等元素（圖2a）。這意味著AFP中鑒定的四種氨基酸具有結(jié)合不同類型金屬離子的能力。

2.2 AFP的金屬離子結(jié)合模式

研究發(fā)現(xiàn)，在AFP的結(jié)構(gòu)中有一種有趣的金屬離子結(jié)合模式，這與Cu、Zn-SOD（PDB：5K02）中觀察到的一致（圖2）。AFP與Cu，Zn-超氧化物歧化酶 （Cu，Zn-SOD） 在結(jié)合銅離子和顯示超氧化物歧化酶活性的能力方面具有相似之處。這表明AFP具有多種功能，不僅促進金屬離子傳輸，而且還可能與調(diào)節(jié)血液中氧化還原反應(yīng)的平衡有關(guān)。

此外，一些金屬元素與AFP的摩爾比超過1，這表明AFP可能在多個位置與金屬離子結(jié)合。選擇Zn²⁺擬合到密度圖中（圖3a），發(fā)現(xiàn)它與His22、His264、His268和Asp280呈四面體配位（圖2b）。通過CheckMyMetal服務(wù)器分析鍵長和金屬配位（圖2c），鋅離子到3個氮原子和1個氧原子的平均距離分別為2.35 ?和2.45 ?。一些參數(shù)，如Valence和nVECSUM不理想，可能是由于在該結(jié)合位點結(jié)合多個金屬離子。該基序為AFP提供了很強的金屬離子結(jié)合能力。His22與Zn²⁺的配位進一步穩(wěn)定了AFP的N端環(huán)結(jié)構(gòu)。胎生動物和卵生動物AFP的金屬離子結(jié)合基序，在序列保守性上存在差異（圖3c）。這表明AFP在金屬離子結(jié)合中的功能作用存在潛在的進化差異。

先前的研究表明，AFP對Zn²⁺?的親和力高于人血清白蛋白（HSA），這可歸因于結(jié)構(gòu)差異，包括存在參與結(jié)合的額外組氨酸殘基。甲胎蛋白是妊娠期間的主要運輸載體。與HSA相比，AFP對金屬離子具有高親和力的一種可能解釋是它需要穿過胚胎-胎兒屏障。此外，從進化的角度來看，AFP的金屬離子結(jié)合基序在胎生動物中表現(xiàn)出更大的保守性（圖3c）。與卵生動物相比，胎生動物的胎兒需要穿過胎盤屏障才能從母體獲取必需的營養(yǎng)物質(zhì)，因此需要更強的親和力。

圖2.金屬離子含量檢測及結(jié)構(gòu)驗證

注：a.用ICP-MS測定AFP中金屬的含量。直方圖的橫軸表示金屬元素。一些含量較低或添加的元素不顯示?？v軸表示金屬與蛋白質(zhì)的摩爾比。AFP-4mut表示四種突變：H22A、H264A、H268A、D280A。AFP-4mut與金屬的摩爾比減小表明金屬與AFP結(jié)合。b.描繪Cu、Zn-SOD（5K02，深青色）和AFP（8X1N，粉色）中金屬離子結(jié)合位點的原子模型。黃色虛線表示離子到殘留物的距離。c. CheckMyMetal服務(wù)器驗證AFP-Zn²⁺。網(wǎng)站地址：https://cmm.minorlab.org/，PDB代碼：8X1N。

圖3.AFP金屬離子結(jié)合位點分析

注：a.甲胎蛋白Zn²⁺和Zn²⁺結(jié)合位點的原子模型和低溫電鏡密度。Zn²⁺結(jié)合殘基用洋紅色棒狀表示，Zn²⁺用灰色球狀表示。密度用黑色網(wǎng)格表示。b. AFP與HSA中Zn²⁺結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)比較。AFP（洋紅色）和HSA-Zn²⁺配合物（5IJF，綠黃色）重疊，結(jié)構(gòu)域I對齊。鋅離子為灰色，氧為紅色，氮為深藍色。金屬離子結(jié)合位點用黑色三角形表示。不變殘基和高度保守殘基分別用紅色陰影和紅色字母表示。

3. AFP與脂肪酸的結(jié)合

在AFP模型中，某些區(qū)域表現(xiàn)出不同的密度圖，表明是獨立結(jié)合的配體，初步推測這些是AFP的天然結(jié)合脂肪酸。GC-MS結(jié)果表明，與AFP結(jié)合的FA中，棕櫚酸（C16:0）含量最多（圖4a），占總FA的57.42%。棕櫚酸的大小與這些密度一致（圖4b）。

3.1 AFP的FA結(jié)合位點

FA結(jié)合位點分別位于AFP亞結(jié)構(gòu)IIA、IIA/IIB、IIIA和IIIB，根據(jù)氨基酸序列順序命名為FA結(jié)合位點-1/2/3/4。FA在結(jié)合位點1處，與AFP的IIA亞結(jié)構(gòu)相互作用。與FA的相互作用主要涉及5個螺旋氨基酸殘基，F(xiàn)A鏈多被疏水性氨基酸包圍。FA羧基的取向由帶正電的極性氨基酸Lys242和Lys246決定，而His266和Met285則有助于形成s形FA構(gòu)象。FA結(jié)合位點-2位于AFP亞結(jié)構(gòu)IIA和IIB之間的界面，位于由四個α螺旋形成的淺槽內(nèi)。三個氨基酸殘基Arg233、Asn348和Gln378作為錨點將FA固定在這個結(jié)合位點上。在FA結(jié)合位點3處，F(xiàn)A呈U型彎曲，完全占據(jù)AFP亞結(jié)構(gòu)IIIA內(nèi)的結(jié)合袋。在FA下方，Glu474與Arg372、Ser408和Arg500之間形成氫鍵，與其他氨基酸形成半封閉的口袋，這可能是導致FA鏈不能向下延伸的原因。FA的羧酸基團可能與Tyr435、Lys438和Ser513殘基相互作用。FA結(jié)合位點-4由橫跨子結(jié)構(gòu)域IIIB的疏水通道形成。FA在袋內(nèi)呈線性延伸。一些極性氨基酸，包括Tyr425、Tyr426、Asn429和Lys549決定了FA羧基的位置。

3.2 AFP的結(jié)合特性

AFP的疏水性分析表明，蛋白質(zhì)的整體外表面是親水的，有利于其存在于血液中。相反，F(xiàn)A結(jié)合口袋為疏水表面，使其適合與疏水分子（如FA）相互作用（圖5a）。此外，AFP表面的負電荷比例較高，這有助于其較低的等電點。值得注意的是，大多數(shù)帶正電的氨基酸側(cè)鏈位于FA結(jié)合口袋的入口，特別是精氨酸和賴氨酸，可能有助于錨定帶負電荷的FA羧基（圖5b）。

此外，使用NanoTemper Tycho NT.6測試蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)脫脂AFP的熱穩(wěn)定性下降。然而，重新引入FA后，其恢復原有的熱穩(wěn)定性（圖4c），說明FA的結(jié)合促進了AFP的熱穩(wěn)定性。

圖4.AFP的脂肪酸結(jié)合位點

注：a.AFP中脂肪酸的GC-MS分析。左圖顯示脂肪酸標準品的色譜圖。右圖為從AFP中提取的脂肪酸色譜圖，主要峰為棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）。所有離子均經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜確認。b.AFP中脂肪酸（FA）結(jié)合位點的整體和細節(jié)特征。左圖顯示了FA在AFP結(jié)構(gòu)中的密度圖和原子結(jié)構(gòu)的空間定位。右圖標注了與FA相關(guān)的氨基酸。FA是棕櫚酸（C16:0），呈紫色。c.采用無標記熱移法檢測AFP的熱穩(wěn)定性。左圖是在沒有和存在給定肉豆蔻酸（MYR）的情況下，通過330 nm熒光發(fā)射得到的甲胎蛋白和脫脂甲胎蛋白的熔化曲線，右圖是這些痕量的一階導數(shù)。彎曲溫度（Ti）表示為三個獨立測量的平均值±SE。

圖5.AFP的疏水性和靜電勢面分析

注：a. AFP中脂肪酸結(jié)合袋的疏水性。b. AFP顯示在平面圖中，并根據(jù)其庫侖勢著色。位于脂肪酸結(jié)合袋入口的氨基酸被標記。

眾所周知，甲胎蛋白具有運輸功能，能夠通過胎盤將某些營養(yǎng)物質(zhì)（FA和金屬離子）從母體血液運輸?shù)脚咛ゼ毎Ｑ芯繄F隊分析了AFP與天然FA結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征。AFP的FA結(jié)合袋不但可以結(jié)合FA，也可能與其他小分子配體結(jié)合。體內(nèi)正常細胞通常沒有AFP受體，胚胎細胞、腫瘤細胞（HCC、乳腺癌、胃癌等）、增殖的肝細胞和一些免疫細胞（如髓源性抑制細胞）等細胞表面具有特異性AFP受體，它們通過其受體介導的細胞內(nèi)吞作用消耗AFP。因此，AFP可以作為轉(zhuǎn)運載體將藥物靶向轉(zhuǎn)運到腫瘤部位，而不會損傷正常細胞。計算機輔助對接技術(shù)可用于篩選對AFP結(jié)合口袋具有高親和力的藥物，通過利用AFP腫瘤靶向特性為癌癥治療帶來潛在的新策略。

參考文獻

Liu K, Wu C, Zhu M, et al. Structural characteristics of alpha-fetoprotein, including N-glycosylation, metal ion and fatty acid binding sites[J]. Commun Biol, 2024,7(1):505.

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