猴痘病毒（MPXV）的檢測(cè)方法

猴痘病毒（Monkeypox virus, MPXV）與天花、牛痘屬于正痘病毒屬（Orthopoxvirus genus）。1970年9月1日，在剛果民主共和國(guó)（當(dāng)時(shí)稱為剛果共和國(guó)）的巴桑庫(kù)蘇醫(yī)院首次發(fā)現(xiàn)了人類MPXV病例。猴痘病毒主要由嚙齒、靈長(zhǎng)類等野生動(dòng)物傳播給人，并在人際間有限的傳播，引起一種罕見的病毒性人畜共患病——猴痘。猴痘臨床癥狀與天花相似，但癥狀較輕。猴痘早前主要發(fā)生在中非和西非靠近熱帶雨林的偏遠(yuǎn)地區(qū)，隨著對(duì)人類的適應(yīng)MPXV逐漸演化為：中非（剛果盆地）和西非兩個(gè)進(jìn)化枝，其中剛果盆地分支毒性和傳播能力更強(qiáng)。

猴痘病毒介紹

猴痘病毒是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，對(duì)宿主細(xì)胞DNA和RNA復(fù)制的依賴程度很低，可在宿主細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。與同屬病毒相似，MPXV很可能在宿主細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制形態(tài)獨(dú)特的胞內(nèi)成熟病毒（IMV）和胞外包膜病毒（EEV）。IMV具有堅(jiān)固的物理結(jié)構(gòu)，便于在宿主之間傳播，而更脆弱的EEV被包膜包裹，限制宿主免疫清除，因此適合病毒在細(xì)胞間傳播。MPXV能有效地感染人原代單核細(xì)胞，通過(guò)抑制CD4+和CD8+ T細(xì)胞活化，消除局部T細(xì)胞反應(yīng)，避免全身免疫抑制及免疫監(jiān)測(cè)。

猴痘病毒臨床診斷

猴痘的最佳診斷樣本來(lái)自皮膚病變——囊泡和膿皰液體，以及干燥的結(jié)痂。病變樣本必須儲(chǔ)存在干燥、無(wú)菌的試管中（無(wú)病毒運(yùn)輸介質(zhì)）并保持低溫。猴痘的臨床診斷必須考慮其他皮疹疾病如：水痘、麻疹、細(xì)菌性皮膚感染、疥瘡、梅毒和藥物相關(guān)過(guò)敏。發(fā)病前期的淋巴結(jié)病可能是區(qū)分猴痘與水痘或天花的唯一臨床特征。

1.1 電鏡活檢

電鏡下MPXV呈胞漿內(nèi)磚狀，有側(cè)體，中心核約200-300 nm。由于OPV物種在形態(tài)上無(wú)法區(qū)分，該方法不能確定診斷，但可以提示該病毒屬于痘病毒科。

1.2 基因檢測(cè)

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

對(duì)臨床、MPXV感染細(xì)胞培養(yǎng)物的MPXV DNA進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，使用PCR或real-time PCR，建議在生物安全三級(jí)設(shè)施中進(jìn)行。采用real-time PCR方法針對(duì)細(xì)胞外包膜蛋白基因（B6R）、DNA聚合酶基因、E9L的保守區(qū)，DNA依賴RNA聚合酶亞基18、rpo18和F3L基因進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）

PCR擴(kuò)增基因或基因片段的限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性（Restriction length fragment polymorphism, RFLP）也可用于MPXV DNA的檢測(cè)，但RFLP費(fèi)時(shí)且需要病毒培養(yǎng)。PCR產(chǎn)物的RFLP也需要酶切后進(jìn)行凝膠電泳，在快速、敏感和特異性至關(guān)重要的臨床環(huán)境中可能不是最佳的方法。

1.2.3 高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）

采用NGS技術(shù)的全基因組測(cè)序仍然是區(qū)分MPXV和其他正痘病毒（OPV）表征的金標(biāo)準(zhǔn)，但該技術(shù)成本較高，測(cè)序數(shù)據(jù)的下游處理需要巨大的計(jì)算能力。因此，在撒哈拉以南非洲資源貧乏的國(guó)家NGS可能不是合適方法。

基因檢測(cè)技術(shù)中real-time PCR仍是MPXV常規(guī)診斷的首選方法，但必須輔以現(xiàn)場(chǎng)基因組測(cè)序技術(shù)，如Oxford Nanopore MinION，才能提供實(shí)時(shí)的病毒基因組數(shù)據(jù)，這對(duì)于循證流行病學(xué)干預(yù)是必不可少。

1.3 免疫檢測(cè)方法

猴痘病毒免疫檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IgG、IgM抗體和免疫組化檢測(cè)病毒抗原。用MPXV抗體進(jìn)行免疫化學(xué)分析，可區(qū)分痘病毒感染和皰疹病毒。

已經(jīng)證實(shí)，抗病毒抗體和T細(xì)胞反應(yīng)在疾病發(fā)作前后增加，在皮疹發(fā)生后5天左右和8天以上的血清中分別檢測(cè)到猴痘病毒IgM和IgG。如果有皮疹和嚴(yán)重疾病史的未接種疫苗的個(gè)體血清中存在IgM和IgG抗體，則診斷可能存在MPXV感染。IgM捕獲ELISA陽(yáng)性表明最近接觸過(guò)MPXV，而IgG捕獲ELISA陽(yáng)性表明該個(gè)體以前通過(guò)接種疫苗或自然感染接觸過(guò)MPXV。在一個(gè)樣本中同時(shí)存在IgM和IgG，表明在以前接種過(guò)疫苗或接觸過(guò)自然感染MPXV的個(gè)體。然而，正痘病毒具有血清學(xué)交叉反應(yīng)性，抗原和抗體檢測(cè)方法不能提供猴痘特異性確認(rèn)，但對(duì)于MPXV流行地區(qū)的血清學(xué)檢測(cè)也許是可行的方法。

參考文獻(xiàn)

[1] Sarah Keasey, Christine Pugh, Alexander Tikhonov, et al. Proteomic Basis of the Antibody Response to Monkeypox Virus Infection Examined in Cynomolgus Macaques and a Comparison to Human Smallpox Vaccination[J]. Plos one, 2010, 5(12): e15547.
[2] Emmanuel Alakunle, Ugo Moens, Godwin Nchind, et al.Monkeypox Virus in Nigeria: Infection Biology, Epidemiology, and Evolution[J]. Viruses, 2020, 12(11):1257.
[3] Erika Hammarlund, Anindya Dasgupta, Clemencia Pinilla, et al. Monkeypox virus evades antiviral CD4+and CD8+T cell responses by suppressing cognate T cell activation[J]. Proc Natl Acad Sci USA,?2008, 105(38): 14567-72.

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